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Apr 28, 2023

Verbesserte Regeneration des Knochengewebes mithilfe eines 3D-Systems

Wissenschaftliche Berichte Band 13,

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 3139 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die mechanischen und biologischen Eigenschaften von Polymilchsäure (PLA) müssen für den Einsatz im Bone Tissue Engineering (HdO) weiter verbessert werden. Mithilfe einer Materialextrusionstechnik wurden erfolgreich dreidimensionale (3D) PLA-Ti6Al4V (Ti64)-Gerüste mit offenen Poren und miteinander verbundenen Kanälen hergestellt. Obwohl die Glasübergangstemperatur von PLA durch die Zugabe von Ti64 anstieg, nahmen die Schmelz- und Kristallisationstemperaturen sowie die thermische Stabilität der Filamente leicht ab. Die Zugabe von 3–6 Gew.-% Ti64 verbesserte jedoch die mechanischen Eigenschaften von PLA und erhöhte die endgültige Druckfestigkeit und den Druckmodul von PLA-3Ti64 auf 49,9 MPa bzw. 1,9 GPa. Darüber hinaus ergab die Fließfähigkeitsbewertung, dass alle Verbundfilamente die Druckanforderungen erfüllten. Bei der Plasmabehandlung von Gerüsten erhöhte sich nicht nur der quadratische Mittelwert (Rq) von PLA (1,8 nm) auf 60 nm, sondern auch sein Kontaktwinkel (90,4°) verringerte sich deutlich auf (46,9°). Die FTIR-Analyse bestätigte die höhere Hydrophilie, da sauerstoffhaltige Gruppen intensiver wurden. Aufgrund der herausragenden Rolle der Plasmabehandlung sowie der Ti64-Zugabe wurde eine deutliche Verbesserung der Anheftung, Proliferation (4′,6-Diamidino-2-phenylindol-Färbung) und Differenzierung (alkalische Phosphatase und Alizarin) mesenchymaler Stammzellen nach Wharton-Gelee beobachtet Rote S-Färbung). Basierend auf diesen Ergebnissen scheint es, dass die hergestellten Gerüste potenzielle Anwendungen bei HdO haben.

Die Knochen des Menschen sind anfällig für schwere Krankheiten und Defekte wie Traumata, Osteoporose und Krebs1. Um diese Krankheiten zu heilen, ist es üblich, nicht biologisch abbaubare metallische Substanzen, im Allgemeinen auf der Basis von Titan und Edelstahl, in den Körper zu implantieren2. Dieser Ansatz führte jedoch zu sekundären chirurgischen Eingriffen, um das Metall aus dem Körper zu entfernen, was Zeit und Material verschwendete3. Die Verwendung von Knochenersatzstoffen hat in letzter Zeit die Aufmerksamkeit vieler Experten auf sich gezogen, um beschädigte Knochen zu reparieren, ohne dass die mit herkömmlichen Methoden verbundenen Katastrophen auftreten4. Dies liegt vor allem daran, dass diese biologisch abbaubaren Materialien bevorzugte Orte für das Wachstum und die Regeneration von neuem Knochengewebe verschiedener Zelltypen sind5. Es ist jedoch wichtig zu erwähnen, dass die Art des Ersatzknochens die einflussreichste Rolle spielt, da dieser ähnliche Eigenschaften wie der ursprüngliche Knochen aufweisen muss. Zu diesen lebenswichtigen Eigenschaften gehört die richtige mechanische Stabilität, die die Haftung, Proliferation und Differenzierung der für die Knochenregeneration verantwortlichen Zellen gewährleistet6. Die meisten hergestellten Knochenersatzmaterialien basieren auf biokompatiblen Metallen und Keramiken, die eine ausreichende Festigkeit aufweisen7. Allerdings schränken einige Nachteile den Einsatz dieser Stoffe in biobasierten Anwendungen ein. Eines der Hauptprobleme besteht darin, dass der Elastizitätsmodul der meisten Keramiken und Metalle deutlich höher ist als der von Knochen, was zu einer unausgewogenen Lastübertragung und einer Knochenresorption als Folge des Stress-Shielding-Effekts führt8,9. Darüber hinaus beeinträchtigen verschiedene Mängel in Keramiken deren Fähigkeit, eine akzeptable Zähigkeit aufzuweisen. Darüber hinaus treten bei der Magnetresonanztomographie (MRT) und der Computertomographie (CT) in der Nähe von Metallimplantaten einige Artefakte auf, die die Genauigkeit der Ergebnisse beeinträchtigen10. Daher ist die Suche nach einem vielversprechenden Biomaterialkandidaten nach wie vor eine große Herausforderung für Forscher.

Derzeit weisen biokompatible Polymere wie Polyetheretherketon (PEEK), Polycaprolacton (PCL) und Polymilchsäure (PLA) aufgrund ihrer biologischen Abbaubarkeit, Nichttoxizität und Nichtimmunogenität ein hohes Potenzial für den Einsatz im Bone Tissue Engineering (BTE) auf nichtentzündliche Eigenschaften 11. Unter einer breiten Palette von Polymerverbindungen wurde PLA, ein thermoplastischer aliphatischer Polyester, als einer der besten Kandidaten für das Hartgewebe-Engineering eingeführt. Dieses kostengünstige Polymer verfügt über eine niedrige Schmelztemperatur und eine akzeptable Biokompatibilität und ebnet den Weg für den Einsatz in HdO12. Ungeachtet der Vorteile von PLA gelten die geringe biologische Aktivität und die geringen mechanischen Eigenschaften als Nachteile, die behoben werden sollten13.

Es wurden zahlreiche Versuche unternommen, die Leistung von PLA-Gerüsten durch das Hinzufügen externer Verstärkungen zu verbessern. PCL beispielsweise hat sich aufgrund seiner Biokompatibilität und Vergleichbarkeit mit der Knochenregenerationsrate als eines der am häufigsten verwendeten Polymere erwiesen. PLA/PCL-Verbundwerkstoffe können jedoch auch schlechtere mechanische Eigenschaften aufweisen, beispielsweise einen niedrigen Modul oder eine geringe Festigkeit14. In einer anderen Studie wurden die Zähigkeit und Duktilität verringert, wenn β-Tricalciumphosphat (β-TCP) als steifer Keramikfüllstoff in PLA eingebettet wurde, was auf die ungleichmäßige Partikelverteilung zurückgeführt wurde15. Während Keramik und Polymere die mechanischen Eigenschaften von PLA nicht verbessern konnten, wurden metallische Füllstoffe aufgrund ihrer faszinierenden Biokompatibilitäts- und Zähigkeitseigenschaften als wirksame Alternativen vorgeschlagen. Eine der jüngsten Studien ergab beispielsweise, dass die Druckfestigkeit der PLA-Matrix durch den Einbau von 5 Gew.-% Magnesiumpulver um 8,3 % erhöht wurde16.

Im letzten Jahrzehnt wurden verschiedene Herstellungsmethoden zur Herstellung von Biokompositgerüsten eingesetzt, darunter Formen, Gasschäumen, Lösungsmittelgießen, Extrusion, Polymerisation und Elektrospinnen17,18. In den meisten Fällen zeigten diese Ansätze jedoch aufgrund der negativen Auswirkungen der Toxizität von Lösungsmitteln oder Restpartikeln keine akzeptable mechanische und biologische Leistung19. In den letzten Jahren wurde der 3D-Druck als effiziente Methode zur Herstellung komplexer poröser Gerüste für das Tissue Engineering eingeführt, indem die interne Geometrie und die Porenstrukturen gesteuert werden20,21. Unter den verschiedenen Arten von 3D-Druckansätzen werden Polymerproben hauptsächlich durch Techniken des Fused Deposition Modeling (FDM) und des selektiven Lasersinterns (SLS) hergestellt22,23. FDM bietet eine größere Flexibilität bei der Materialhandhabung und eine bessere Kosteneffizienz bei der Herstellung poröser Strukturen ohne den Einsatz von Lösungsmitteln wie bei der Stereolithographie (SLA) und SLS24,25. Bei diesem auffälligen Verfahren wird ein thermoplastisches Zufuhrfilament aus einer beheizten Düse extrudiert und gleichzeitig die Filamentkügelchen auf dem Druckbett verfestigt, was für die Herstellung von Verbundgerüsten wünschenswert ist26.

Obwohl einige Studien zur Herstellung und Untersuchung gedruckter Gerüste aus Polymer-/Metall-Verbundwerkstoffen durchgeführt wurden und vielversprechende Ergebnisse erbracht haben, bestehen weiterhin einige Probleme. Beispielsweise wurden 3D-gedruckte Gerüste aus PLA/Titan27 und PLA/Reineisen28 mithilfe der FDM-Technik hergestellt; Obwohl diese Studien nützliche Ergebnisse erzielten, zeigten sie jedoch nicht, dass mit dieser Technologie hochwertige Filamente (mit konsistentem Durchmesser, ausreichender Partikeldispersion und vernachlässigbarer Porosität) hergestellt werden können. In einer anderen Untersuchung29 wurden 3D-gedruckte PLA/Zink-Gerüste mithilfe der FDM-Technologie gedruckt; Allerdings wurde keine biologische Analyse durchgeführt und die Gerüste zeigten keine Verbesserung der mechanischen Eigenschaften. Darüber hinaus stellten Cifuentes et al.16 und Jiang et al.30 3D-gedruckte PLLA/Magnesium- bzw. PLA/316L-Edelstahlgerüste her, legten jedoch keine Hinweise zur rheologischen und biologischen Bewertung bei.

Die Ti6Al4V (Ti64)-Legierung ist die am weitesten verbreitete Metalllegierung bei der additiven Fertigung orthopädischer Implantate31 und bietet eine Reihe von Vorteilen, darunter eine hervorragende Biokompatibilität bei Kontakt mit Knochen und Gewebe, eine hohe Wahrscheinlichkeit, die Osteoblastenreifung zu fördern, und eine osteogene Eigenschaft Eine Umgebung entsteht, wenn osteoblastenähnliche Zellen auf ihrem Substrat kultiviert werden, was die Knochenbildung verbessern könnte32. Dennoch sind die gebräuchlichsten additiven Fertigungstechniken zur Herstellung von Ti64-Implantaten SLS, selektives Laserschmelzen (SLM) und Elektronenstrahlschmelzen (EBM)33. Es wurden zahlreiche Studien zur Entwicklung und Verbesserung orthopädischer Ti64-Implantate als vollmetallische Implantate durchgeführt, damit sie den Anforderungen von Knochenimplantaten gerecht werden34,35,36,37,38. Nach unserem Kenntnisstand wurde Ti64 jedoch noch nicht für die Verwendung als metallischer Zusatzstoff in MEAM-Techniken (Material Extrusion Additive Manufacturing) wie FDM und SLA untersucht, die alle zur Herstellung von Verbundgerüsten auf Polymerbasis verwendet werden.

Obwohl 3D-gedruckte Gerüste viele Orte bieten, an denen Zellen anhaften können, können ihre Eigenschaften durch einige Nachbehandlungen weiter verbessert werden39. Früheren Arbeiten zufolge können die Biokompatibilität orthopädischer Materialien, die Zelladhäsion, die Proliferation und die Differenzierung von Zellen durch den Einsatz eines breiten Spektrums an Oberflächenmodifizierungsmethoden wie Biofunktionalisierung, Beschichtung und nicht-thermische Plasmabehandlung verbessert werden40,41. Im Vergleich zu den oben genannten Prozessen wurde berichtet, dass die Plasmabehandlung Nanorauheiten auf der Gerüstoberfläche erzeugt, die Benetzbarkeit verändert und die Oberfläche mit funktionellen Gruppen wie Sauerstoffatomen (d. h. reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)) bei geringerer Herstellung modifiziert Kosten und Komplexität42. Beispielsweise erhöhten nach der Plasmabehandlung des PCL/HA/MgO-Gerüsts mit O2 und N2 die physikalische Oberflächenmorphologie und die chemischen Oberflächeneigenschaften des 3D-Gerüsts die Adhäsion, Proliferation und Differenzierung von MC3T3-E1-Zellen im PCL/HA/ MgO-Gerüste43.

Dementsprechend wurde diese Studie durchgeführt, um die Eignung von Ti6Al4V (Ti64) als alternatives metallisches PLA-Verstärkungsmittel zu untersuchen. Mithilfe des FDM-basierten 3D-Drucks wurden 3D-Gerüste aus PLA-Ti64 mit verschiedenen Ti64-Gehalten (0, 3, 6 und 9 Gew.-%) konstruiert und unter dem Gesichtspunkt mechanischer, physikalischer, thermischer, Fließfähigkeit und biologischer Aspekte untersucht und mikrostrukturelle Eigenschaften. Im Rahmen der Studie wurde eine optimierte Konzentration von Ti64 basierend auf mechanischen Eigenschaften und einem Zelllebensfähigkeitstest ausgewählt. Anschließend wurde das ausgewählte PLA-Ti64-Gerüst mit Sauerstoff und Luftplasma behandelt, um zu bestimmen, wie sich die Plasmabehandlung auf die physikalischen und biologischen Eigenschaften der Gerüste auswirkt. Zu diesem Zweck wurden Adhäsion, Proliferation und Differenzierung der mesenchymalen Wharton-Gelee-Stammzellen auf den mit Plasma behandelten Gerüsten untersucht. Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung der Vorbereitungs- und Charakterisierungsschritte für das 3D-poröse PLA/Ti64-Verbundgerüst.

Schematische Darstellung der Methode zur Herstellung poröser dreidimensionaler PLA/Ti64-Verbundgerüste.

Es war eine große Herausforderung, Biokomposite herzustellen, bei denen die Verstärkungen gleichmäßig in der Matrix verteilt sind. Um dieses Problem zu überwinden, sollte nach bisherigen Arbeiten die optimierte Menge an Füllstoff gewählt werden44. Daher wurde im ersten Schritt der Einfluss unterschiedlicher Konzentrationen von Ti64 (0, 3, 6, 9 Gew.-%) auf die Oberflächenmorphologie der PLA-Filamente mittels Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop (FESEM) untersucht. Wie in Abb. 2a–d zu sehen ist, wurde die Oberfläche mit zunehmender Füllstoffmenge relativ rauer und es wurden mehr Kratzer festgestellt. Einerseits ist diese Rauheit auf die auf der Oberfläche des Filaments verteilten Ti64-Mikropartikel zurückzuführen. Andererseits führt eine Reibungskraft, die während des Extrusionsprozesses auf den geschmolzenen Verbundstoff ausgeübt wird, dazu, dass die Füllstoffe einige Schwänze in Form gezackter Linien auf der PLA-Oberfläche hinterlassen30. Basierend auf Abb. 2e–h, die Querschnittsansichten senkrecht zur Filamentachse zeigen, obwohl die Verteilung der weißen Ti64-Partikel in PLA-3 Gew.-% Ti64 (PLA-3Ti64) und PLA-6 als homogen befunden wurde Bei Proben mit Gew.-% Ti64 (PLA-6Ti64) traten einige Agglomerationen im Filament PLA-9 Gew.-% Ti64 (PLA-9Ti64) auf, was der Bildung von Mikrohohlräumen in PLA45 entspricht. Diese agglomerierten Partikel spielten eine destruktive Rolle als starke Barrieren gegen den PLA-Fluss und behinderten die Matrixkondensation46. Abbildung 2i–l vergleicht die FESEM- und optischen Bilder von 3D-gedruckten Proben aus reinem PLA und PLA-6Ti64. Das Fehlen von Mängeln wie Mikrorissen, Delaminationen und Hohlräumen an den Gerüststreben zeigt offenbar die hohe Qualität der gedruckten Muster. Um festzustellen, wie genau 3D-gedruckte Gerüste hinsichtlich ihrer Abmessungen waren, wurde die Größe von Poren und Streben gemessen. Basierend auf der statistischen Analyse gab es keine merkliche Veränderung in der Porengröße, Porosität und Strebenbreite der Proben, die mit 270 µm, 35 % bzw. 380 µm aufgezeichnet wurden, was etwas kleiner als die angepassten Werte (300 µm) war , 40 % und 400 µm). Solche geringfügigen Unterschiede entstehen durch die Volumenschrumpfung während des Druckvorgangs aufgrund des negativen Wärmegradienten von der Düse zum Druckbett47. Diese offenen Poren und miteinander verbundenen Kanäle spielen eine herausragende Rolle dabei, den Zellen aktivere Stellen für die Infiltration und das Wachstum bereitzustellen und den Transport von Nährstoffen, Sauerstoff und Stoffwechselabfällen zu erleichtern48.

FESEM-Bilder zeigen die Oberflächenmorphologie (ad) und Querschnittsansichten (e–h) von reinem PLA (a, e) und Verbundfilamenten mit 3 Gew.-% (b, f), 6 Gew.-% (c, g), und 9 Gew.-% (d, h) Ti64. Blaue und gelbe Pfeile in (h) beziehen sich auf Mikrohohlräume bzw. Agglomerationen. FESEM mit einem Sekundärmodus (i, j) und Stereomikroskopbildern (k, l) von 3D-gedruckten Gerüsten aus reinem PLA (i, k) und PLA-6Ti64 (j, l).

Es ist erwähnenswert, dass in der in Abb. S1 dargestellten Analyse der energiedispersiven Röntgenspektroskopie (EDX) nicht nur Ti-, Al-, V-, C- und O-Peaks vorhanden sind, die mit Ti64- und PLA-Gegenstücken in Zusammenhang stehen, sondern auch die Das Fehlen von Chloridionen in den Filamenten könnte ein positives Zeichen dafür sein, dass das gefährliche Material während des Herstellungsprozesses vollständig aus dem Verbundfilament entfernt wurde.

Die thermischen Eigenschaften von PLA wurden mittels Differential Scanning Calorimetry Analysis (DSC) bewertet, um den Einfluss des Ti64-Gehalts zu bestimmen. Die Glastemperatur (Tg) ist ein wichtiger Parameter, der die Kettenmobilität von Polymeren in Abhängigkeit von der Temperatur angibt49. Es wurde berichtet, dass der Tg-Wert stark von der Art der Verstärkung abhängt. Während beispielsweise die Hydroxylapatit/Silber-Kern-Schale-Struktur (HA@Ag) die Glastemperatur von PLA erhöhen konnte, zeigten Fe3O4-Partikel mit zunehmendem Füllstoffgehalt einen umgekehrten Trend50,51. In unserer Umfrage erlebte die Tg von PLA (57 °C) ähnlich wie bei der HA@Ag/PLA-Struktur einen Aufwärtstrend und erreichte 59,8 °C, 61,6 °C und mehr, wenn mehr Ti64-Partikel in die reine PLA-Matrix geladen wurden 62,7 °C für Verbundwerkstoffe mit 3, 6 bzw. 9 Gew.-% Ti64 (Abb. 3a und Tabelle 1). Ein leichter Anstieg der Tg kann auf die störende Rolle von Ti64-Partikeln zurückgeführt werden, die die Kettenbeweglichkeit und Schmierung von PLA52 behinderten. Im Gegensatz zu den Änderungen der Tg sank jedoch die Kaltkristallisationstemperatur (Tc) durch die Erhöhung der Ti64-Konzentration allmählich von 97 (reines PLA) auf 89,4 °C (PLA-9Ti64). Je mehr Ti64-Partikel vorhanden sind, desto mehr Keimbildungsstellen bilden die bevorzugten Orte für die Kristallisation von PLA, was zu einer Verringerung der Kaltkristallisationstemperatur führt27. Ein weiterer kritischer Parameter, der von der Ti64-Konzentration beeinflusst wird, ist die Kristallisationskapazität von PLA (Xc). Während der Wert von Die erste Beobachtung wird wahrscheinlich auf die dispergierten Ti64-Partikel als Keimbildner zurückgeführt, die den Weg für die Kristallisation von PLA durch heterogene Keimbildung ebneten. Der Rückgang hängt jedoch wahrscheinlich mit den agglomerierten Ti64-Partikeln zusammen, die als Konzentrationsspannungszentren gelten und die PLA-Mobilitätsketten und die Kristallisation einschränken53. Darüber hinaus zeigte der PLA-Schmelzpunkt durch die Erhöhung des Ti64-Gehalts den gleichen sinkenden Trend wie der Tc-Schmelzpunkt. Ti64-Partikel mit derselben Rolle bei der Kristallisation können als Keimbildungsstellen fungieren und das Schmelzen vorgeformter Kristalle bei niedrigeren Temperaturen während des Erhitzens beschleunigen54.

DSC-Kurven von reinem PLA-Filament und Verbundfilamenten mit verschiedenen Ti64-Gehalten (a). XRD-Ergebnisse von 3D-gedruckten Proben (b).

Außerdem wurde eine Röntgenbeugungsanalyse (XRD) durchgeführt, um die chemische Zusammensetzung und Phasenkristallisation verschiedener 3D-gedruckter PLA-Ti64-Verbundwerkstoffe zu untersuchen. Wie in Abb. 3b dargestellt, zeigt ein breiter Peak in reinem PLA, der sich bei einem Beugungswinkel von 16° befindet, die Bildung der amorphen Phase des Polymers55. Mit zunehmender Ti64-Konzentration wurden nicht nur die scharfen Hauptpeaks bei 35°, 38° und 40°, die mit den {100}-, {002}- und {101}-Ebenen von Ti64 in Zusammenhang stehen, intensiver, aber auch der PLA-Kristallpeak wurde schmaler und schärfer50. Die erste Beobachtung lässt sich damit erklären, dass die Spitzenintensität von Ti64 direkt zu einem Anstieg der Ti64-Konzentration führt. Der zweite Grund ergibt sich jedoch aus der Kristallinitätsverbesserung von PLA gemäß den DSC-Ergebnissen.

Die thermische Stabilität ist eine entscheidende Eigenschaft, die die Druckfähigkeit von Proben zum Ausdruck bringt. Es ist offensichtlich, dass hohe oder niedrige Temperaturverschlechterungen sich negativ auf die Qualität von 3D-gedruckten Proben auswirken56. Um dies zu beenden, ist es entscheidend, den Wert dieses Parameters auf einen akzeptablen Bereich oberhalb und nahe der Fenstertemperatur einzustellen. Um die thermische Stabilität von Filamenten zu untersuchen, wurden in Abb. 4a-c die Änderungen des Gewichtsverlusts als Funktion der Temperatur aufgetragen. Dazu werden verschiedene Temperaturen eingeführt, darunter die Temperatur des beginnenden Abbaus (T0), die Temperatur bei 15 % Gewichtsverlust (T15), die Temperatur bei 50 % Gewichtsverlust (T50) und die Temperatur, bei der die Zersetzung endet (Te). markiert. Erstens wurde in allen Proben nur ein thermischer Zersetzungsschritt im Temperaturintervall von 300 °C bis 410 °C beobachtet. Wenn den reinen PLA-Proben höhere Mengen Ti64 zugesetzt wurden, sanken alle oben genannten Temperaturen, was zeigt, dass die Partikel den PLA-Abbau beschleunigten16. Ti64-Partikel verfügen über eine große Anzahl aktiver Zentren sowie adsorbiertes und absorbiertes Wasser auf ihren Oberflächen und wirken so als Depolymerisationskatalysatoren für den PLA-Abbau50. Ein weiterer wahrscheinlicher Grund kann auf den Molekulargewichtsverlust und das Vorhandensein kürzerer Ketten zurückgeführt werden16. Es ist bemerkenswert, dass trotz der Abwärtsverschiebung der Abbautemperaturen für mit Ti64 beladene PLA-Proben die gemessenen Werte immer noch über den Extrusions- und 3D-Drucktemperaturen (Fenstertemperaturen) liegen, die bei 195 bzw. 210 °C liegen, was die Proben belegen ' Hervorragende Druckfähigkeiten. Darüber hinaus stimmte die aus der Analyse berechnete Restmasse weitgehend mit den Nennwerten für Verbundfilamente mit einem Füllstoffgehalt von bis zu 6 Gew.-% überein und zeigte, dass Ti64-Partikel gleichmäßig in der PLA-Matrix verteilt sind. Der Unterschied zwischen den erhaltenen und den berechneten Werten für 9 Gew.-% Ti64 ist jedoch ein Zeichen für die in den FESEM-Ergebnissen beobachtete inhomogene Verteilung der Partikel im PLA27.

TGA- (a–c), Scherviskositätskurven (d) und MFI-Ergebnisse (e) von PLA-Ti64-Verbundfilamenten.

Rheologische Eigenschaften und Schmelzflusseigenschaften gelten im Allgemeinen auch als zwei wesentliche Faktoren für die Beurteilung der Materialextrusionsverarbeitbarkeit und Druckbarkeit von Polymeren und Polymerverbundwerkstoffen57,58. Wie in Abb. 4d dargestellt, zeigte die Fließkurve aller Filamente einen Nullviskositätsbereich, gefolgt von einem exponentiellen Abfall der gemessenen Viskosität, was auf ein Scherverdünnungsverhalten bei höheren Schergeschwindigkeiten hinweist. In dieser Studie wurde ein Düsendurchmesser von d = 0,4 mm bei einer Druckgeschwindigkeit von v = 35 mm/s verwendet, sodass die ungefähre Druckscherrate auf \(\dot{\gamma }\) ≈ v⁄d geschätzt wurde ≈ 90 s−1 59. Daher gewährleistet die bemerkenswerte nicht-Newtonsche Eigenschaft von Filamenten eine deutliche Verringerung der Viskosität an der Düse während des Materialflusses bei der geschätzten Druckscherrate und anschließend einen schnellen Anstieg der Viskosität, wenn das Material aufgetragen wird auf dem Bett. Darüber hinaus wurde die Viskosität von reinem PLA verringert, wenn Ti64-Mikropartikel eingearbeitet wurden. Die Verringerung der Viskosität in Verbundfilamenten kann auf die Rolle mikrometergroßer Partikel bei der Verringerung der Reibung der Schmelze und des Abbaus von PLA-Molekülketten zurückgeführt werden, was durch thermogravimetrische (TGA) Analyse bestätigt wurde50,59. Obwohl festgestellt wurde, dass die Viskositätswerte von Verbundfilamenten niedriger sind als die von reinem PLA, liegen die Werte immer noch im Bereich von 100–300 Pa.s. Der Literatur zufolge kann ein solcher Viskositätsbereich die Fließfähigkeit von Materialien gewährleisten und die strukturelle Integrität während bzw. nach dem Druckvorgang bewahren 59. Abbildung 4e zeigt die Ergebnisse der Schmelzflussindexprüfung (MFI) für PLA- und PLA-Ti64-Verbundfilamente. Ähnlich dem beobachteten Trend in der rheologischen Studie waren die durchschnittlichen MFI-Werte für Verbundwerkstoffe denen von reinem PLA überlegen. Darüber hinaus stieg der MFI mit dem Ti64-Gehalt leicht an und lag zwischen 24 und 31 (g/10 Min.). Diese Ergebnisse zeigen, dass die MFI-Werte bei der Materialextrusionstechnik innerhalb des Druckbarkeitsfensters liegen45. Die höhere Fließfähigkeit der PLA/Ti64-Matrix führte beim 3D-Druck zu dünnen und gleichmäßigen Schichten.

3D-gedruckte Gerüste erfordern akzeptable mechanische Eigenschaften, um für HdO-Anwendungen verwendet zu werden. Angesichts der Tatsache, dass reines PLA mit schlechten mechanischen Eigenschaften kein großes Potenzial für biobasierte Anwendungen aufweist, wurden robuste Ti64-Verstärkungen in die Matrix eingebettet, um die mechanischen Eigenschaften von reinem PLA zu verstärken. Es wurden Druck- und Zugtests durchgeführt, um die Wirkung von Ti64 auf die mechanischen Eigenschaften von reinem PLA zu untersuchen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Wie in Abb. 5a-d zu sehen ist, erhöhte sich der Zugmodul der PLA-Matrix (1,3 GPa) bei steigender Füllstoffkonzentration erheblich und erreichte den Wert von 2,0 GPa für PLA-9Ti64. Die Zugabe von Füllstoff erwies sich auch als wirksam bei der Verbesserung der Zugfestigkeit und Dehnung von PLA, die 31,4 MPa und 3,9 auf 35,1 MPa und 5,4 für die PLA-3Ti64-Probe betrugen. Der Aufwärtstrend für diese Parameter kehrte sich jedoch um und die Mittelwerte sanken leicht auf 32,9 MPa und 4,1 für die PLA-6Ti64-Probe, gefolgt von einem deutlichen Rückgang auf 30,5 MPa und 3,1 für die PLA-9Ti64-Probe, was ungefähr dem gleichen Wert entsprach der erzielten Ergebnisse in reinem PLA. Ein ähnliches Muster wurde auch bei den Kompressionsergebnissen beobachtet, mit dem Unterschied, dass die PLA-6Ti64-Probe den höchsten Wert der endgültigen Druckfestigkeit erreichte (Tabelle 3 und Abb. 6a–d). Diesen Ergebnissen zufolge könnten diese Gerüste für kraniofazialen Knochen60 und trabekulären Knochen61 verwendet werden. Die rechtfertigenden Gründe für die beobachtete Verstärkung der Zug- und Druckergebnisse können wie folgt erklärt werden. Einigen Veröffentlichungen zufolge steht die schwache Bindung zwischen den Verstärkungen und der Matrix in direktem Zusammenhang mit schlechten mechanischen Eigenschaften62. Wie in den DSC-Ergebnissen erläutert, ist die Abwärtsverschiebung des Tc-Werts durch die Erhöhung der Ti64-Konzentration ein wertvoller Beweis dafür, dass PLA Ti64-Partikel als bevorzugte Keimbildungsorte fand, was wahrscheinlich die Tendenz von PLA und Ti64 zum Kontakt zeigt63. Es ist wichtig zu beachten, dass durch diese Wechselwirkung zwischen der Matrix und dem Füllstoff die zusätzliche Belastung, der PLA nicht standhalten konnte, effektiv in Ti64-Partikel übertragen werden kann, wodurch der Verbundstoff gestärkt wird64. Ein weiterer Grund für dieses Phänomen könnte mit der hervorragenden Verteilung des Füllstoffs zusammenhängen, ohne dass auf der Oberfläche der PLA-3Ti64- und PLA-6Ti64-Verbundwerkstoffe Agglomerationen und Mikrohohlräume entstehen. Der Rückgang der Festigkeit des PLA-9Ti64-Verbundwerkstoffs kann jedoch eine Folge einiger Ansammlungen und Hohlräume sein, die in FESEM-Bildern nachgewiesen wurden (Abb. 2). Um ein besseres Verständnis des mechanischen Verhaltens der untersuchten Materialien zu erhalten, wurden die Bruchflächen von Proben untersucht und verglichen.

Zugkurven (a), Zugmodul (b), Zugfestigkeit (c) und Dehnung (d) von PLA/Ti64-Verbundgerüsten (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, * ***p < 0,0001). FESEM-Mikroaufnahmen von Bruchflächen von Gerüsten aus reinem PLA (e), PLA-3Ti64 (f), PLA-6Ti64 (g) und PLA-9Ti64 (h).

Druckkurven (a), Druckmodul (b), maximale Druckfestigkeit (c) und Dehnung (d) von PLA-Ti64-Verbundgerüsten (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, * ***p < 0,0001).

Wie in Abb. 5e–h dargestellt, war die Bruchfläche von reinem PLA zwar glatt, was zeigt, dass PLA einen spröden Bruch erlitt, es wurden jedoch auf der Oberfläche von Verbundwerkstoffen bemerkenswert viele Grübchen und plastisch verformte Bereiche beobachtet, die für duktiles Verhalten repräsentativ sind Bruch65,66. Dieses Ergebnis steht im direkten Einklang mit der Verbesserung der Duktilität (Dehnung) bei Zugversuchen. Darüber hinaus gibt es neben zwei Arten von Porositäten, darunter Gasporen (die während des Filamentherstellungsschritts entstehen (Typ A)) und dreieckige Zwischenschichtporen (die während des Druckschritts zwischen verschiedenen einzelnen Schichten entstehen (Typ B)), noch eine andere Art von Porosität entsteht durch das Herausziehen von Ti64-Partikeln während des Zugversuchs (Typ C)65. Diese Poren weisen darauf hin, dass die geladene Zugkraft vor der Ti64-Ablösung effektiv von der Matrix auf die Füllstoffe übertragen wurde, wodurch die mechanischen Eigenschaften des PLA67 verbessert wurden.

Obwohl die Temperatur der thermischen Zersetzung von Verbundwerkstoffen bei einer Erhöhung der Ti64-Konzentration auf bis zu 6 Gew.-% leicht anstieg, wurden die mechanischen Eigenschaften und die Steifigkeit dieser Verbundwerkstoffe erheblich verbessert. Die Zugabe von 9 Gew.-% Ti64 zu PLA führte jedoch weder zu einer Verbesserung der mechanischen Eigenschaften, noch verstärkte sie den thermischen Abbau. Daher wurde der optimale Ti64-Bereich auf 3 bis 6 Gew.-% eingestellt.

Mehreren Untersuchungen zufolge reagiert die glatte und hydrophobe Oberfläche von Polymeren nur ungern mit verschiedenen funktionellen Gruppen, was als Abschreckung gegen Zelladhäsion und -proliferation wirkt68. Um diese Herausforderung zu meistern, wurde eine nicht-thermische Plasmabehandlung (PT) eingesetzt, um die PLA-3Ti64-Oberfläche in Gegenwart von Luft und O2 zu modifizieren. Basierend auf den in Abb. 7a und b dargestellten Ergebnissen der Rasterkraftmikroskopie (AFM) ist der leichte Anstieg der quadratischen Rauheit der PLA-3Ti64-Probe (Rq: 1,8 nm) im Vergleich zu reinem PLA (Rq: 0,99 nm) zu erkennen. hängt wahrscheinlich mit den abgelagerten kleinen Ti64-Partikeln auf der Oberfläche im untersuchten Fenster von 10 µm × 10 µm zusammen. Nach der Oberflächenbehandlung der PLA-3Ti64-Probe mit O2 (Abb. 7c) wurde die Oberfläche rauer und Rq erreichte den Wert von 35 nm, was etwa dem Fünfzehntel des Werts der unbehandelten Probe entsprach. Überraschenderweise erwies sich PT in der Luft als wirksamer, da der Rq etwa verdoppelt wurde (60 nm), was die unglaubliche Kraft der Luftbehandlung beim Aufrauen der Oberfläche demonstriert (Abb. 7d).

AFM-Ergebnisse von 3D-gedruckten Proben von unbehandeltem reinem PLA (a), unbehandeltem PLA-3Ti64 (b), PLA-3Ti64 (PT-O2) (c) und PLA-3Ti64 (PT-Luft) (d). (Bilder (a–d) wurden mit der NOVA-Software generierthttps://www.ntmdt-si.com/products/afm-features/nova-px-control-program (NT-MDT, Version 1.0.26.1443)). ATR-FTIR von unbehandelten und behandelten Proben (e).

PT ist in der Lage, Polymeroberflächen mit verschiedenen Spezies wie Ionen, Atomen und angeregten Molekülen zu bombardieren, wodurch die Oberfläche geätzt und modifiziert wird, indem die Polymerketten aufgebrochen werden und sich wiederholende Peak-Tal-Strukturen im Nanobereich gebildet werden69. Darüber hinaus kann PT einen erheblichen Einfluss auf die Hydrophobie von PLA haben, indem es dessen Oberfläche verändert. Wie in Abb. S2a und b zu sehen ist, verringerte sich der Kontaktwinkel der PLA-Probe durch die Zugabe von Ti64-Partikeln von 90,4 auf 76,8°, was möglicherweise mit der Zunahme der Rauheit von PLA-3 Gew.-% zusammenhängt. Ti64-Gerüst im Vergleich zum reinen PLA-Gerüst70. Als die PLA-3Ti64-Probe in O2- und Luftumgebungen behandelt wurde, verringerten sich die Kontaktwinkel erheblich und erreichten Werte von 54° bzw. 46° (Abb. S2c und d). Diese höhere Hydrophilie plasmabehandelter Proben kann durch die Ergebnisse der Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (ATR-FTIR) erklärt werden. Abbildung 7e zeigt das ATR-FTIR-Spektrum für reines PLA, PLA-3Ti64, mit O2 behandeltes PLA-3Ti64 und mit Luft behandeltes PLA-3Ti64. Der Peak bei 1080 cm−1 wird der –O–C=O-Bindung zugeschrieben. Bei 1181 cm−1 ist der beobachtete Peak für die Streckung der –CHO-Bindung verantwortlich. Der Peak bei 1265 cm−1 stammt von der CO-Bindung der Estergruppe in PLA71. Außerdem gibt es einen scharfen Peak bei 1745 cm−1, was C=O entspricht. Der Hauptunterschied zwischen der Verbundprobe und reinem PLA besteht darin, dass der Peak bei 1745 cm−1 bei Zugabe von Ti64 leicht abnahm. Laut einigen früheren Arbeiten kommt es wahrscheinlich zu einer teilweisen Wechselwirkung zwischen zwei Verbindungen, PLA und Ti6472,73,74, wenn die Intensität eines Peaks bei 1745 cm−1 abnimmt. Bei der Plasmabehandlung der Proben mit O2 und Luft stieg die Intensität der sauerstoffhaltigen Bindungen, einschließlich –O–C=O, –CH–O, C=O und C–O, direkt in Zusammenhang mit der Sauerstoffzahl Fesseln. Wenn Ionen, Atome und angeregte Moleküle auf die Oberfläche von PLA treffen, ätzen sie die Oberfläche und verursachen einen Bruch der Polymerketten. Diese Stellen beginnen mit der Luft zu interagieren und sauerstoffhaltige Verbindungen zu bilden. Darüber hinaus kann das Auftreten von Absorptionspeaks zwischen 3650 und 3300 cm−1, bei 950 cm−1 und 832 cm−1 sowie eines weiteren verstärkten Peaks bei etwa 1370 cm−1 nach der Behandlung wahrscheinlich auf die verantwortlichen OH-Streckschwingungen zurückgeführt werden zur Erhöhung der Hydrophilie der Proben75,76,77.

Die Wirksamkeit des Einbaus von Ti64-Mikropartikeln in PLA-Gerüste wurde mithilfe eines Zellüberlebensexperiments untersucht. Abbildung 8a zeigt die Zelllebensfähigkeitsanalyse an den Tagen 1, 3 und 5 nach der Aussaat von WJ-MSCs auf Gerüsten, was darauf hinweist, dass die entwickelten PLA-basierten Gerüste im Vergleich zur Kontrollprobe eine akzeptable Zelllebensfähigkeit aufweisen.

Studie zur Lebensfähigkeit und Proliferation von Zellen. MTT-Assay-Analyse (a), DAPI-Färbung (b–e) und SEM-Analyse (f–i) von hergestellten Proben nach 5 Tagen Zellkultur. (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001).

Die reine PLA-Probe zeigte an den Tagen 1, 3 und 5 einen ähnlichen Trend im Vergleich zur Kontrolle, während der Einbau von 3 und 9 Gew.-% Ti64 die Zelllebensfähigkeit unterschiedlich beeinflusste, was zu der höchsten bzw. niedrigsten Menge am Tag 1 führte. Die PLA-6Ti64-Probe besitzt einen Zelllebensfähigkeitswert zwischen PLA-3Ti64 und PLA-9Ti64. Die erhaltenen Ergebnisse deuten jedoch darauf hin, dass die Plasmamodifikation an den hergestellten PLA-3Ti64-Gerüsten zu einer geringeren Lebensfähigkeit der Zellen am ersten Tag führte (91,281 und 97,268, mit O2 bzw. Luft) im Vergleich zur PLA-3Ti64-Ersatzprobe.

Am dritten Tag wurde die maximale Lebensfähigkeit der Zellen den reinen PLA- und plasmabehandelten Proben mit Luft gewidmet, mit einer statistisch signifikanten Verbesserung (p < 0,0001). Im Gegensatz dazu war PLA-6Ti64 das schädlichste Gerüst für die Lebensfähigkeit der Zellen. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die mit Plasma behandelten Proben mit Luft am 5. Tag die höchste Zelllebensfähigkeit aufwiesen, mit einer deutlich höheren Menge (p < 0,0001) als andere Proben.

Basierend auf den erhaltenen Ergebnissen wurde deutlich, dass die Einarbeitung der Ti64-Mikropartikel die Lebensfähigkeit der Zellen beeinflusst und dass eine Erhöhung ihres Gehalts auch einen größeren Einfluss hatte. Dies könnte mit den Ionen und Molekülen begründet werden, die die zusätzlichen Mikropartikel freisetzten78; Daher würden die Ergebnisse je nach den verwendeten Mikropartikeln variieren. Lee et al.27 berichteten, dass Zellen auf PLA/Ti-Verbundgerüsten im Vergleich zu Zellen, die an reine PLA-Gerüste gebunden waren, nachweislich stärker gedehnt und ausgebreitet wurden und auch ihre Proliferation beschleunigt wurde. Ihre Arbeit legte nahe, dass eine Erhöhung des Ti-Gehalts von 0 auf 15 Vol.-% zu einer Verbesserung der Lebensfähigkeit, Proliferation und osteogenen Differenzierung der Zellen im Vergleich zu den reinen PLA-Gerüsten führte.

In Bezug auf die Oberflächenmodifikation vorbereiteter 3D-gedruckter Gerüste wurde gezeigt, dass die Plasmabehandlung die Lebensfähigkeit der Zellen leicht erhöhte, was weitgehend mit früheren Studien übereinstimmte. Roh et al.43 wiesen darauf hin, dass die Plasmabehandlung das Verhalten der Zellen verändern könnte, indem sie die Oberflächenmorphologie und die chemischen Eigenschaften des 3D-Gerüsts verändert. Es scheint, dass die Anpassung der Gerüstoberfläche und die Erhöhung der Rauheit zu einer Erhöhung des Bindungspotentials der Zellen führen, was sich auf das Überleben und die Ausbreitung der Zellen auswirkt79.

Dementsprechend wurden die Gerüste mit 6 und 9 Gew.-% aus weiteren zellulären Tests weggelassen, um anwendbare Tests durchzuführen und verstärkte Knochengerüste zu entwickeln. Die Bewertung wurde unter Berücksichtigung von vier Proben durchgeführt, darunter reines PLA, PLA-3Ti64, PLA-3Ti64 (PT-O2) und PLA-3Ti64 (PT-Luft).

4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), ein praktischer Fluoreszenzfarbstoff, macht Kern-DNA sowohl in lebenden als auch in fixierten Zellen nachweisbar80. Kerne wurden identifiziert und die gesamte Zellmorphologie mithilfe der DAPI-Färbung 21 Tage nach der Zellaussaat auf den Gerüsten bewertet (Abb. 8b – e). Wie diese Zahlen veranschaulichen, zeigten die PLA-3Ti64-Verbundgerüste im Vergleich zu den reinen PLA-Gerüsten eine höhere Zellausbreitung und -proliferation. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse, dass die Zellclusterung in plasmabehandelten Gerüsten zu einer stärkeren Zellausbreitung und -proliferation führte, während die PLA-3Ti64-Probe (PT-Luft) eine erhöhte Zellproliferation aufwies als mit Plasma behandelte Proben mit O2. Gleichzeitig sind beide im Vergleich zu unbehandelten Komposit- und Reinproben überlegen. Die erhaltenen Ergebnisse korrelieren mit früheren Erkenntnissen und bestätigen, dass eine höhere Oberflächenrauheit zu einer stärkeren Zellanhaftung, Ausbreitung, Proliferation und Funktionalisierung führt79. Wang et al.81 berichteten, dass ihre Versuche, die Oberfläche der 3D-gedruckten PLA-basierten Gerüste durch Plasmabehandlung anzupassen, die Hydrophilie und die nanoskalige Rauheit erhöhten, was die Osteoblastendifferenzierung sowie die Adhäsion und Proliferation mesenchymaler Stromazellen erheblich steigerte. In dieser Arbeit betrug, wie bereits erwähnt, die Oberflächenrauheit von PLA-3Ti64 (PT-Luft), PLA-3Ti64 (PT-O2), PLA-3Ti64 und reinem PLA 60, 35, 1,8 bzw. 0,99 nm. Angesichts der Daten und Ergebnisse sind die Zellanhaftung, -ausbreitung, -proliferation und -morphologie bei plasmabehandelten Proben, insbesondere bei mit Luftplasma behandelten Proben, beträchtlich. Unsere Erkenntnisse zur Zellproliferation auf PLA-Gerüsten zeigen, dass die Plasmaoberflächenbehandlung die Zellproliferation fördert. Nanoskalige Oberflächen, die durch Plasmabehandlung erzeugt wurden, erhöhten die Zelladhäsion, -proliferation und sogar morphologische Veränderungen auf der Gerüstoberfläche, wie die Zellproliferationsdaten von WJ-MSC zeigen. Diese Ergebnisse wurden anhand von REM-Bildern von Proben mit fixierten Zellen bestätigt (Abb. 8f – i).

Um den Einfluss der Plasmabehandlung auf die Osteogeneseaktivität von WJ-MSCs zu untersuchen, die auf einem 3D-gedruckten PLA/Ti64-Verbundgerüst ausgesät wurden, wurde die ALP-Enzymaktivität gemessen, die dem frühen Stadium der osteogenen Differenzierung entspricht82. Abbildung 9a zeigt die ALP-Enzymaktivität von WJ-MSCs, die 7 und 14 Tage lang auf den hergestellten Gerüsten ausgesät wurden. In Bezug auf die 7 Tage wurde festgestellt, dass der Einbau von 3 Gew.-% Ti64 in PLA-Substrat die ALP-Enzymaktivität erhöhte, obwohl diese Steigerung statistisch nicht signifikant ist. Andererseits erhöhte die Plasmaoberflächenbehandlung der Verbundgerüste die ALP-Enzymaktivität im Vergleich zu den reinen PLA-Proben deutlich (p < 0,01), während PLA-3Ti64 (PT-Luft) oder PLA-3Ti64 (PT-O2) wiesen keine signifikanten Unterschiede voneinander auf. Allerdings änderte sich die Situation innerhalb von 14 Tagen nach der Zellkultur auf den entwickelten 3D-gedruckten Gerüsten. Die PLA-3Ti64-Gerüste zeigten im Vergleich zu den reinen PLA-Proben eine deutlich erhöhte ALP-Enzymaktivität (p < 0,0001), wohingegen PLA-3Ti64 (PT-O2) im Vergleich zur Verbundprobe keine signifikante Verbesserung aufwies. Interessanterweise zeigten die mit Luft plasmabehandelten Proben eine erhebliche Steigerung der ALP-Enzymaktivität im Vergleich zu den mit O2-Plasma behandelten und reinen PLA-Proben (p < 0,0001).

Studie zur osteogenen Differenzierung. ALP-Aktivitätsanalyse (a), ARS-Färbungsanalyse (b) und ARS-Färbung nach 7 Tagen (c–f) und 14 Tagen (g–j) nach der Zellkultur. (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001).

Reife Osteoblasten produzieren und lagern die Mineralmatrix ab, die hauptsächlich aus Calciumphosphat in Form von Hydroxylapatit besteht und die letzte Stufe der Osteoblastendifferenzierung darstellt. Die Fähigkeit von WJ-MSCs, anorganisches Kalzium in der Mitte der Differenzierungsphase zu mineralisieren, gemessen durch anorganische Mineralablagerung, weist auf eine osteogene Differenzierung hin. In dieser Studie veranschaulichten die ARS-Färbungsergebnisse die vorteilhafte Wirkung der plasmaoberflächenmodifizierten Gerüste auf die Mineralisierung der extrazellulären Matrix (ECM) von Osteoblasten. Abbildung 9b zeigt das Analysediagramm der ARS-Färbung für WJ-MSCs, die 7 und 14 Tage lang auf vorbereitete Proben ausgesät wurden. Es wurde beobachtet, dass die durchschnittliche OD bei 405 nm für reine PLA-Proben am 7. Tag 0,2598 betrug, während sie für PLA-3Ti64-Substrat auf 0,3572 anstieg. Außerdem erhöhte die Modifizierung der Oberflächeneigenschaften der Gerüste durch Plasmabehandlung den Gehalt an abgelagertem Kalzium auf 0,4402 bzw. 0,4662 für O2- bzw. Luftbedingungen. Abbildung 9c–f zeigt den abgelagerten Kalziumgehalt der differenzierten Zellen auf den vorbereiteten Gerüsten für 7 Tage. Die erhaltenen qualitativen Ergebnisse validieren die numerischen Analysen, während die Ergebnisse für die ARS-Färbung positiv mit dem ALP-Assay korrelieren.

Der interessante Punkt bei diesem Test ist, dass die Oberflächenbehandlung der Proben mit Plasma unter O2- und Luftbedingungen den Kalziumgehalt nach 14 Tagen auf 0,6988 bzw. 0,768 erhöhte; Dies bedeutet, dass die Kalziumablagerung durch das Aufrauen der Oberfläche und eine bessere Zellanhaftung, -proliferation, -aktivität und -differenzierung im Vergleich zu den bloßen Gerüsten deutlich erhöht wurde (Abb. 9g – j).

Das osteogene Gerüstpotenzial kann durch die Untersuchung erklärt werden, wie die Plasmaoberflächenbehandlung die Oberflächenmikroumgebung verändert. Da nachweislich das Zellverhalten durch die Struktur der Gerüstoberfläche beeinflusst wird, verleiht die chemische Zusammensetzung des Gerüsts seine biologischen Fähigkeiten83. Wie bereits erwähnt, konnte in dieser Untersuchung festgestellt werden, dass die Plasmabehandlung der Gerüste die Oberflächenrauheit erhöhte und die chemische Zusammensetzung der Oberfläche veränderte (Abb. 7a–e). Überraschenderweise konnte die Tatsache, dass eine Erhöhung der Oberflächenrauheit die Zellanhaftung, -ausbreitung, -proliferation und -differenzierung verbessern würde, je nach Material, Gerüst, Art der Plasmabehandlung und verwendeten Zellen außer Kraft gesetzt werden84.

Diese Studie zeigte den erfolgreichen 3D-Druck von PLA-Ti64-Verbundgerüsten mit miteinander verbundenen Poren. Die Auswirkungen der Zugabe unterschiedlicher Mengen (3, 6 und 9 Gew.-%) Ti64 zu PLA auf die mechanischen und biologischen Eigenschaften sowie die Auswirkungen der Plasmabehandlung mit Sauerstoff und Luft auf die weitere Verbesserung der biologischen Eigenschaften von PLA-Ti64-Gerüsten , im Hinblick auf Zellanhaftung, Proliferation und Differenzierung, wurden untersucht. Die wichtigsten Schlussfolgerungen lassen sich wie folgt zusammenfassen.

Das Fehlen schädlicher Mängel, einschließlich Mikrorissen, Delaminierung und Hohlräumen an den Streben der gedruckten Gerüste, zeigte die hohe Qualität der gedruckten Muster.

Die Zugabe von Ti64 zum PLA um 6 Gew.-% verbesserte alle mechanischen Eigenschaften, einschließlich Druckmodul, Zugfestigkeit und Duktilität, deutlich.

Die Glasübergangstemperatur stieg mit zunehmendem Ti64-Gehalt an, was darauf hindeutet, dass Ti64 ihre thermischen Eigenschaften teilweise beeinflusste. Allerdings kam es zu einer Abnahme der Zersetzungs-, Kristallisations- und Schmelztemperatur.

Die Plasmabehandlung erhöhte die Hydrophilie und Rauheit der PLA-Ti64-Gerüstoberfläche. In dieser Hinsicht erwies sich die Plasmabehandlung mit Luft als wirksamer.

Die Zugabe von Ti64-Partikeln in Kombination mit einer Plasmabehandlung führte zu einer verbesserten Adhäsion, Proliferation und Differenzierung der mesenchymalen Wharton-Gelee-Stammzellen.

Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass PLA-3Ti64 (PT-Luft)-Gerüste unter den verschiedenen untersuchten Proben bessere mechanische und bioaktive Eigenschaften aufwiesen und die idealen Kriterien für Knochengewebe-Engineering-Ersatzstoffe erfüllten.

Polymilchsäurepellets (PLA 4032D, NatureWork LLC, USA) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht (Mw) von 19.600 kg/mol, kugelförmiges Ti64-Pulver der Güteklasse 23 (AP&C, Kanada) mit einem Größenverteilungsbereich von 10–50 Mikrometern (Abb. S3) und Dichlormethan (DCM, Biotech-Qualität 99,9 %, Sigma-Aldrich, Deutschland) wurden zur Herstellung von PLA/Ti64-Verbundwerkstoffen verwendet. Einzelheiten zur Filamentherstellungsmethode werden an anderer Stelle85 erläutert und hier kurz beschrieben. Zunächst wurden PLA-Pellets 6 Stunden lang bei 60 °C in einen Ofen gelegt, um Feuchtigkeit zu entfernen. Dann wurde Ti64-Pulver mit drei verschiedenen Konzentrationen (3, 6 und 9 Gew.-%) in ein Becherglas mit 10 ml DCM gegossen und 1 Stunde lang gerührt, um die Dispersion zu fördern. Anschließend wurden die resultierenden Verbindungen mit einem Handmixer mit getrockneten PLA-Pellets vermischt, um die DCM/Ti64-Mischung gleichmäßig auf der Oberfläche der PLA-Pellets zu verteilen. Die erhaltenen PLA/Ti64-Mischungen wurden 16 Stunden lang bei 70 °C in den Ofen gestellt, um DCM zu entfernen. Anschließend wurden die endgültig getrockneten Proben in einen Einschneckenextruder mit zwei Düsen (Temperatur 195 °C) und einer Schneckengeschwindigkeit von 35 U/min gegeben, um die endgültigen PLA/Ti64-Filamente mit einem Durchmesser von 1,75 mm herzustellen. An der Auslassdüse wurden zwei Ventilatoren installiert, um die Temperatur der Filamente zu senken. Abschließend wurden die aus der Austrittsdüse kommenden Filamente um eine Spule geschlungen. Abb. S4 zeigt das Bild von extrudierten Filamenten aus reinem PLA und PLA/6 Gew.-% Ti64.

Zum Drucken von Gerüsten wurde ein kommerzieller Materialextrusionsaufbau (Dayan K12S, Borna3D Inc., Iran) mit einer Düsengröße von 400 µm verwendet. Zunächst wurden Gerüste mit der Solidwork-Software (Version 23.0) in der kubischen Abmessung von 1 × 1 × 0,8 cm mit einer Strebenbreite und Porengröße von 400 µm bzw. 300 µm entworfen. Dann werden mithilfe der MankatiUM-Software (Version 6.5) verschiedene Druckparameter, einschließlich Druckgeschwindigkeit (35 mm/s), Düsentemperatur (210 °C), Betttemperatur (55 °C), Schichthöhe (300 µm), und Füllmuster (− 45°/ + 45°) wurden eingestellt. Um die nominale Porosität von 40 % zu erreichen, wurde der Füllanteil der Proben auf 60 % eingestellt. Nach dem Druckvorgang drückte eine Andruckrolle die Filamente zur beheizten Düse. Anschließend wurde das Filament geschmolzen und durch die Düse eingespritzt, wobei sich die Schmelze auf einem vorgeheizten Druckbett ablagerte. Abschließend wurden die Proben vom Bett gelöst und durch mehrere Tests charakterisiert.

Um die Oberflächenrauheit zu verbessern und die Zellanhaftung zu fördern, wurden Sauerstoff- und Luftplasmabehandlungen mit einem Niederdruck-Plasma-Oberflächentechnologiesystem (Zepto11, Diener, Deutschland) unter Verwendung einer Radiofrequenz (RF) von 13,56 MHz durchgeführt. Die HF-Entladungsleistung, die O2- und Luftgasströmungsraten und der Arbeitsdruck RIE betrugen 75 W, 15 sccm (Standardkubikzentimeter pro Minute) bzw. 225 × 10−3 Torr. Beide Seiten von 3D-gedruckten Gerüsten wurden 6 Minuten lang behandelt.

FESEM (Tescan Mira3, Tschechische Republik), ausgestattet mit EDX, wurde zur Bewertung der Morphologie und/oder chemischen Zusammensetzung von Ti64-Pulvern, Filamenten, 3D-gedruckten Gerüsten und Bruchflächen sowie für Zellanlagerungsstudien verwendet. Die Oberfläche der Proben wurde zunächst durch Sputtern mit Gold beschichtet, um die Oberfläche leitfähig zu machen und die Ansammlung elektrischer Ladung an der Oberfläche während der REM zu verhindern. Zur Beurteilung der Oberflächenqualität der 3D-gedruckten Gerüste wurde auch ein Zoom-Stereomikroskop (SZ51, Olympus, Japan) verwendet. AFM (TS-150, NT-MDT, Russland) wurde verwendet, um die Topographie und Rauheit der plasmabehandelten und unbehandelten 3D-gedruckten Gerüste zu untersuchen. AFM-Bilder wurden im Klopfmodus bei Raumtemperatur aufgenommen und der quadratische Mittelwert (RMS) wurde mit der NOVA-Software (Version 1.0.26.1443) berechnet.

Eine TGA-Analyse (TA Instruments Q50, USA) wurde durchgeführt, um die thermische Stabilität von Biokompositfilamenten zu untersuchen. Um dies zu erreichen, wurden 10 mg jeder Probe in einen Aluminiumoxidtiegel gegeben und unter einer Argonatmosphäre mit einer Geschwindigkeit von 10 °C/min von 30 auf 510 °C erhitzt. Außerdem wurde eine DSC-Analyse (TA Instruments Q100, USA) durchgeführt, um den Kristallinitätsgrad der Materialien sowie ihr Schmelz- und Kristallisationsverhalten zu beurteilen. Dabei wurden 10–15 mg jeder Probe unter einer Argonatmosphäre mit einer Heizrate von 10 °C/min von 30 auf 210 °C erhitzt. Der Kristallinitätsgrad (XC) wurde durch die folgende Gleichung bestimmt: 86:

Dabei sind ΔHm, ΔHc und ΔH0 die Enthalpien des Schmelzens, der Kaltkristallisation bzw. von 100 % kristallinem PLA (93,1 J/g).

Die Scherviskositätsmessung wurde mit einem Rotationsrheometer Anton Paar MCR 301 mit parallelen Geometrien (Plattendurchmesser = 25 mm, Spalt = 1 mm) bei 210 °C untersucht. Der MFI-Test der Filamente wurde gemäß ASTM D1238 unter Verwendung eines Geotech GT-7100-MI-Geräts durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden 2,16 kg der Last auf den Kolben ausgeübt und die Zylindertemperatur wurde auf 210 °C gehalten. Schließlich wurde das durch die Düse geflossene Material 10 Minuten lang beobachtet.

Die Kristallstruktur der Phasen in 3D-gedruckten Gerüsten wurde mittels XRD-Analyse untersucht. XRD mit gefilterter Cu-Kα-Strahlung (Wellenlänge bei 1,5405 Å) wurde mit einem Philips-Gerät PW1730 bei einem Strom von 30 mA und einer Spannung von 40 kV über den 2θ-Bereich von 5–80° durchgeführt.

Die chemischen Funktionsgruppen von PLA/Ti64-Gerüsten und ihre Veränderungen durch Plasmabehandlung wurden mittels FTIR (Thermo, USA) untersucht. Die FTIR-Spektren wurden mit einem Perkin-Elmer-Spektrometer im Bereich von 4000 cm–1 bis 400 cm–1 unter Verwendung eines abgeschwächten Totalreflexionsmoduls (ATR) gesammelt.

Zur Beurteilung der Hydrophilie verschiedener Proben wurde eine Kontaktwinkelmessung (WCA, Veho USB Microscope 400X, China) eingesetzt. Hierzu wurden 10 µL destilliertes Wasser auf die vorgesehene Oberfläche getropft. Das Experiment wurde für jede Probe wiederholt und die Durchschnittsergebnisse wurden angegeben.

Zug- und Drucktests wurden an 3D-gedruckten Proben gemäß den Standards ASTM D638 und D695 durchgeführt, um die mechanischen Eigenschaften von PLA/Ti64-Verbundwerkstoffen zu bestimmen. Eine universelle Santam-Prüfmaschine (STM-20, Santam Co., Iran) wurde verwendet, um Zug- und Druckkräfte bei konstanten Traversengeschwindigkeiten von 5 mm/min bzw. 1,3 mm/min bei Raumtemperatur auszuüben. Um die Reproduzierbarkeit der Proben zu untersuchen, wurden die Experimente mindestens dreimal wiederholt und die Mittelwerte angegeben.

Whartons gelartige mesenchymale Stammzellen (WJ-MSCs) wurden von der Firma SinaCell (Iran) gekauft und einem MTT-Test unterzogen, nachdem sie unterschiedlichen Dosen von 3D-gedruckten PLA-Ti64-Gerüsten ausgesetzt wurden. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden 1 × 104 Zellen auf Kulturplatten mit 96 Vertiefungen ausgesät und nach einem Tag Kultur den vorgeschriebenen Gerüsten ausgesetzt. Nach 1, 3 und 5 Tagen wurde jede gut aufgenommene 100 ml MTT-Lösung (0,5 mg/ml) 3 Stunden lang inkubiert. Anschließend wurde die MTT-Lösung entnommen und durch 100 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) ersetzt. Schließlich wurde die Absorption der Proben (bei 570 nm) in dreifacher Ausfertigung mit einem Mikroplatten-Lesegerät (BioTek Co., USA) gemessen und die Ergebnisse zur Lebensfähigkeit mit der Kontrollprobe verglichen und als Zelllebensfähigkeitsprozentsatz angegeben.

Für die SEM-Analyse wurden Zellen auf der Oberfläche vorbereiteter Proben fixiert, indem sie eine Stunde lang in Glutaraldehyd (2,5 Gew.-%) getaucht und dann in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült wurden. Die Dehydratisierung erfolgte anschließend durch 5-minütiges Eintauchen der Probe bei 37 °C in jede Ethanolkonzentration (30, 50, 70, 80, 90, 95 und 99 %). Nach Erhalt einer Goldbeschichtung wurden die Proben einer Hochspannungs-REM-Analyse unterzogen.

Um eine ALP-Assay-Analyse durchzuführen, wurden WJ-MSCs auf den vorbereiteten Gerüsten in einer Dichte von 2 × 104 Zellen pro Vertiefung kultiviert. Die Kontroll- und Testgruppen erneuerten das Kulturmedium nach 24 Stunden. Die Medien wurden an den Tagen 7 und 14 entnommen und die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen, in 200 l 0,2 Prozent TritonX-100 lysiert und dreimal bei jeweils –20/37 °C eingefroren/aufgetaut. Nach 30-minütiger Zentrifugation der Zelllysate bei 3000 U/min wurden 50 l des Überstands in eine frische 48-Well-Platte überführt und mit 200 l p-Nitrophenylphosphatlösung (Pars Azmoun Company, Iran) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemischt. Die OD wurde bei 405 nm mit einem Mikroplatten-Lesegerät gemessen.

Die Kalziumablagerung von WJ-MSCs wurde durch ARS-Färbung nachgewiesen. Ungefähr 4 × 104 WJ-MSCs wurden auf den vorbereiteten Gerüsten ausgesät, jedes Gerüst in jeder Vertiefung der 24-Well-Platte, und das Medium wurde nach zwei Tagen von den Behandlungsgruppen aufgefrischt. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und nach 7 und 14 Tagen 1 Stunde lang in 4% Formaldehyd fixiert. Nach einem weiteren Waschvorgang wurden die Zellen 40 Minuten lang mit 2 Gew.-% Alizarinrot (Sigma-Aldrich, USA) inkubiert. Anschließend wurden die Zellen viermal mit destilliertem Wasser gewaschen, bevor sie mit einem Umkehrmikroskop (Olympus, Japan) untersucht wurden.

In dieser Arbeit wurde eine Immunfluoreszenz-Bewertung durchgeführt, um den Zellzyklus zu untersuchen und zu analysieren und Zellkerne mithilfe der DAPI-Färbung nachzuweisen. Um das Auftreten von Zelltod zu untersuchen und festzustellen, ob der Zelltod vom apoptotischen Typ ist oder nicht, wurden Fluoreszenzmikroskopie (Leica, TCS SP-8, Deutschland) und DAPI-Färbung (Firma Sigma-Aldrich, Deutschland) verwendet. Bei dieser Färbung erscheinen normale Zellen als einheitliche blaue Farbe. Allerdings sind die Kerne apoptotischer Zellen aufgrund der Chromatinkondensation und Fragmentierung des Kerns unregelmäßig als leuchtend blaue Punkte sichtbar87. Die DAPI-Lösung wurde durch Auflösen von 1 mg DAPI in 1 ml destilliertem Wasser hergestellt. Um den Zelltod zu bewerten, wurden ausgesäte WJ-MSCs auf den Gerüsten eine Stunde lang kultiviert, bevor die Zelloberfläche entfernt, mit PBS gewaschen, mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und mit DAPI bei einer Dichte von 300 nm angefärbt wurde.

Alle Grafiken und statistischen Analysen wurden mit der Origin-Software (Version 2021) erstellt. Die P-Werte wurden durch eine einseitige Variationsanalyse mit Bonferroni-Mehrfachvergleichen berechnet, wobei P < 0,05 als statistisch signifikant angesehen wurde. Jeder Test wurde mindestens dreimal wiederholt und die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben.

In dieser Studie wurden weder Menschen noch Tiere verwendet.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

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Diese Autoren trugen gleichermaßen bei: Motahareh Shabani Dargah und Mahdi Hasanzadeh Azar.

Abteilung für Materialwissenschaft und Werkstofftechnik, Sharif University of Technology, Teheran, Iran

Masoud Zarei, Reza Alizadeh, Sayed Shahab Sayedain und Mohammad Asadollahi

Abteilung für Biomedizintechnik, Technische Universität Amirkabir, Teheran, Iran

Motahareh Shabani Dargah

Department of Engineering Physics, McMaster University, Hamilton, Kanada

Mahdi Hasanzadeh Azar

Abteilung für Biotechnologie, College of Science, Universität Teheran, Teheran, Iran

Fatemeh Sadat Mahdavi

Polymeric Materials Research Group (PMRG), Abteilung für Materialwissenschaft und -technik, Sharif University of Technology, Teheran, Iran

Alireza Kaviani

Abteilung für Tissue Engineering, School of Advanced Technologies in Medicine, Medizinische Universität Teheran, Teheran, Iran

Mahmoud Azami und Nima Beheshtizadeh

Regenerative Medicine Group (REMED), Universal Scientific Education and Research Network (USERN), Teheran, Iran

Masoud Zarei, Mahmoud Azami und Nima Beheshtizadeh

Joint Reconstruction Research Center (JRRC), Medizinische Universität Teheran, Teheran, Iran

Mahmoud Azami

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MZ: Konzeptualisierung, Methodik, Validierung, formale Analyse, Untersuchung, Datenkuration, Überwachung, Schreiben – Originalentwurf, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Visualisierung. MSD und MHA: Methodik, formale Analyse, Untersuchung, Schreiben – Originalentwurf, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung. RA: Konzeptualisierung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Überwachung, Projektverwaltung, Finanzierungseinwerbung. FSM: Untersuchung. SSS: Ressourcen, Untersuchung. AK: Schreiben – Originalentwurf, formale Analyse. MA: Software, Untersuchung. MA: Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten. NB: Schreiben – Originalentwurf, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Überwachung, Visualisierung.

Korrespondenz mit Masoud Zarei, Reza Alizadeh oder Nima Beheshtizadeh.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Zarei, M., Shabani Dargah, M., Hasanzadeh Azar, M. et al. Verbesserte Regeneration des Knochengewebes mithilfe eines 3D-gedruckten Poly(milchsäure)/Ti6Al4V-Verbundgerüsts mit Modifikation der Plasmabehandlung. Sci Rep 13, 3139 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30300-z

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Eingegangen: 01. Dezember 2022

Angenommen: 21. Februar 2023

Veröffentlicht: 23. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30300-z

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